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干貨 | 為什么qPCR高手都愛用0.1ml管?

    小編之前寫過一篇關于白色PCR管和透明PCR管相比較的文章,之后就有很多小伙伴@小編,詢問除了顏色不同外,為什么實驗室里的大師兄都開始用0.1ml的PCR管了?普通0.2ml管和0.1ml管對qPCR實驗結果會有什么不同的影響嗎?

    首先,我們先來看一下市場上這些主流qPCR儀,比如國外的ABI(賽默飛)的7500 Fast,Roche的LightCycler96和LightCycler480,Bio-Rad的CFX96 Touch,安捷倫的AriaMx等以及國內的朗基Q1000/Q1000+和Q2000系列,它們都已經以0.1ml管為標配耗材,像賽默飛更是向定量PCR用戶推薦優先選擇低容(0.1ml)耗材。趨勢已來,勢不可擋。

    那么在定量PCR實驗中,為什么0.1mlPCR管比普通0.2ml管有著天然的優勢呢?且聽小編慢慢道來。

    首先我們看外形,普通管要比0.1ml管高很多(見圖1)

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    而恰恰因為兩者高度上的差異,造就了0.1ml管即將擁有開掛的一生。

縮小死體積,避免掛壁冷凝水

    當加入同樣體積的反應液時,相比0.2ml管,0.1ml管的反應液上方空間(也稱死體積)則相對小得多,浪費的空間就更少(見圖2)實驗中隨著樣品臺逐漸升溫,管內加熱后產生的水蒸氣會進入上方空間,普通管容納了更多的水蒸氣,導致反應液被濃縮,反應液成分的變化進而影響到導熱性和液體溫度,從而影響實驗結果的穩定性和精確性。相反,對于0.1ml管來說,就會大大減少死體積,使得反應成分更穩定,重復性更好。

    另外,由于普通管中的水蒸氣要經過更長距離的裸露部分才能到達頂部的熱蓋處(見圖3),不可避免地導致一些冷凝水掛壁現象的形成,這對熒光定量PCR實驗是致命的。因為掛壁的冷凝水就像一個個微型透鏡,造成熒光的折射和散射,劣化并衰減檢測器信號的一致性,降低靈敏度。

    而0.1ml管由于被樣品臺充分包裹,裸露在樣品臺外面的部分極少,與熱蓋的距離也更近,大大降低了掛壁冷凝水的產生,以及冷凝水污染的可能性,當然實驗數據就更準確啦。


圖圖圖

圖2 


圖3

圖3    

短光程,提高熒光捕獲率

    由于試劑成本越來越高,實驗設計的反應體積越來越小,最常見就是20-25ul,甚至在定量PCR實驗中,5-10ul的用戶也是屢見不鮮,對0.1ml管來說綽綽有余,即使加50ul 也不在話下(見圖4)

    對于頂部檢測的熒光定量PCR儀來說,在同等體積下,從激發光進入反應液到產生的熒光被探測器接收,PCR管的高度越低,光經過的路程(即光程)就越短,(0.1ml管比普通管的光程縮短達10.6mm),檢測器的熒光捕獲率就更高,實驗的結果就越美麗。


圖4

圖4


    總之,當聯合使用0.1ml管和白管時,更可以發揮1+1>2的效果,即使在2.5-5ul的極限體積下,也可以得到較好的擴增曲線,有圖為證(見圖5)


圖5

2.5ul 10倍稀釋樣品擴增曲線


圖6

圖5   5ul 四通道多重試劑擴增曲線


    現在小伙伴們明白了為什么qPCR高手都愛用0.1ml PCR管了吧。也許你還習慣使用普通管,小編寫此文就是希望能讓你改變思路,擁抱未來呢。

    正所謂濃縮的皆是“精華”——0.1ml管(白管更佳)將是熒光定量PCR實驗成功的致勝法寶!


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